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登革熱實驗室檢測
確診登革熱病毒感染的實驗室檢測方法包括分離登革病毒,、檢測病毒的核酸,、抗原或抗體或幾種檢測方法的聯(lián)合使用。從病人標本中分離到登革病毒,，檢測到病毒核酸,、抗原，血液中IgM抗體陽轉(zhuǎn),，或恢復(fù)期血標本IgG抗體滴度較急性期有4倍或以上升高可以確診登革病毒感染,。單份血標本IgM或IgG抗體陽性不能確診登革病毒感染，單份標本抗體檢測陽性時,，僅可臨床診斷為疑似或可能病例,，確診需要急性期和恢復(fù)期雙份血清標本。
?。ㄒ唬┑歉锊《靖腥九c機體免疫反應(yīng)
登革病毒感染后,，潛伏期為3～14天，通常4～7天,，潛伏期內(nèi)采集的患者標本尚不能檢出登革病毒或相應(yīng)的機體免疫反應(yīng),。發(fā)病后，病毒在血液中存在的時間（病毒血癥期）約為7天,，病毒NS1抗原在血液存在的時間略長,。發(fā)病后4～5天內(nèi)，可在病人的血清,、血漿,、白細胞、腦脊液和尸檢組織標本中分離到病毒,，病毒核酸及NS1抗原在這個時期的檢出率高,。病人血液中抗體水平，因個體免疫狀態(tài)不同而具有顯著差異,。若以前沒有感染過登革病毒或其他黃病毒,，或接種過黃病毒疫苗（如：乙腦、黃熱等）,，病人首次感染抗體免疫反應(yīng)呈現(xiàn)為特異性抗體水平緩慢升高,，IgM抗體出現(xiàn)最早，隨后出現(xiàn)的是IgA和IgG抗體,。在發(fā)病后3～5天的患者中IgM抗體檢出率約為50%,，發(fā)病后第5天的患者中檢出率約為80%,，而在發(fā)病后第10天患者中，約99%的患者可檢出,。IgM抗體水平在發(fā)病后2周達高峰,，然后逐步下降，可保持2～3個月,。IgA抗體出現(xiàn)略晚于IgM抗體,，可保持約45天。在發(fā)病一周后,，可在血液標本中檢出較低滴度的IgG抗體,，之后抗體滴度緩慢升高，可持續(xù)存在多月甚至終生,。如果病人屬于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染過登革病毒,，有時可能是曾接種其他黃病毒疫苗或感染過其他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病毒產(chǎn)生反應(yīng),。主要為高水平的IgG抗體,，在急性期即可檢出，可持續(xù)存在10個月以上,，甚至終生,。IgA抗體也可在急性期標本中檢出。再次感染登革病毒的病人恢復(fù)期早期的IgM抗體滴度明顯低于首次感染,，甚至無法檢出,，通過計算IgM/IgG抗體比例，可以區(qū)分首次或再次登革病毒感染,。IgA抗體檢測試劑在臨床診斷中的應(yīng)用尚處于評價階段,。
（二）檢測方法選擇
在發(fā)病的早期（發(fā)病5天內(nèi)）一般采用病毒分離,、核酸檢測或抗原檢測等方法進行診斷,，當病程進入恢復(fù)期后（發(fā)病5天以后），一般采用血清學(xué)檢測病毒特異性抗體的方法進行診斷,。
1. 病毒分離,。經(jīng)細胞培養(yǎng)分離病毒，需要生物安全二級（BSL-2)實驗室及必要的儀器設(shè)備,，在標本運輸過程中保持低溫（冷凍或冷藏）對于病毒分離非常重要,。將標本接種于蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養(yǎng),，出現(xiàn)病變以后,，用檢測抗原或核酸的方法鑒定病毒,。分離到登革病毒可以確診,，但其耗時長,，需要數(shù)天，不適于快速診斷,。
2. 核酸檢測,。多種逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法可用于登革病毒核酸檢測，包括一步法RT-PCR,、實時熒光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等,。核酸檢測可在1～2天內(nèi)鑒別病毒RNA。在病人標本中檢出病毒核酸,，可確診且能分型,，可用于早期診斷，但核酸檢測容易因污染而產(chǎn)生假陽性,，因此要求嚴格分區(qū)操作,。陰性結(jié)果不能排除登革熱診斷，需采集第二份標本（發(fā)病5天后）開展血清學(xué)檢測,，進行確診,。
3. 抗原檢測。NS1抗原檢測可采用ELISA方法或快速檢測試劑,，可在幾十分鐘到數(shù)小時完成檢測,，適于現(xiàn)場使用，是登革熱急性期診斷的重要手段,，在發(fā)病后1天即可檢出,，也有報道在發(fā)病后18天仍可在血標本中檢出。目前該方法尚不能分型,。由于NS1抗原檢測方法的特異性,，也可用于黃病毒感染的鑒別診斷?；谖覈歉餆崃餍械奶攸c,，國家衛(wèi)生計生委頒發(fā)的《登革熱診療指南（2014年第2版）》將標本中檢出NS1抗原作為確診病毒感染依據(jù)，可用于早期診斷,。但綜合現(xiàn)有試劑的穩(wěn)定性和特異性以及現(xiàn)場疫情處置需要等因素考慮,，《登革熱診斷標準WS 216-2018》將標本中檢出NS1抗原作為臨床診斷病例標準而非確診病毒感染依據(jù)。NS1抗原檢測陰性結(jié)果不能排除登革熱診斷,，需采集第二份標本（發(fā)病5天后）開展血清學(xué)特異性抗體檢測,，進行確診或排除診斷。
4. IgM抗體檢測,。用于IgM抗體檢測的捕獲法ELISA（MAC-ELISA）是最常用的檢測方法,，也有多種商業(yè)化快檢試劑可用于IgM抗體檢測，均不能用于血清分型檢測,。目前檢測試劑主要是檢測病毒包膜蛋白特異性抗體,，主要缺陷為與其他黃病毒存在交叉反應(yīng),。標本中IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染登革病毒,，適用于登革熱早期診斷,，但單份標本不能確診。一些登革病毒再次感染者,，血標本中IgM抗體滴度底,，甚至不能檢出，影響IgM抗體診斷精確性,。
5. IgG抗體檢測,。可采用ELISA,、免疫熒光（IFA）,、免疫層析等方法檢測。登革病毒IgG抗體與其他黃病毒有交叉反應(yīng),。IgG抗體檢測可以用來鑒定首次感染和再次感染,，如果急性期標本IgG抗體陰性，恢復(fù)期陽轉(zhuǎn),，則可確定為首次感染,；如果急性期患者血標本中IgG/IgM比值明顯升高（受抗體檢測試劑盒敏感性影響，尚無明確的指示值）,，或發(fā)病后3天內(nèi)IgG水平明顯升高,，提示再次感染；患者恢復(fù)期血標本IgG抗體滴度較急性期(兩份標本間隔應(yīng)不少于7天）呈4倍及以上升高可確診為登革病毒感染,。采集第二份標本進行確診或排除診斷對于登革熱防控具有重要意義,，尤其是非流行區(qū)。
6. 中和抗體檢測,?？瞻邷p少中和實驗（Plaque Reduction and Neutralization Test，PRNT）和微量中和實驗可用來檢測血清中的中和抗體,，是型特異的血清學(xué)檢測方法,，可以分型。需要生物安全二級（BSL-2)實驗室及必要的儀器設(shè)備,，耗時長,，需要數(shù)天，不適于快速診斷,?；颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。
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