寨卡病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案
寨卡病毒(Zika Virus)屬黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),,呈球形,直徑約為40-70nm,,有包膜,。基因組為單股正鏈RNA,,長度約為10.8Kb,,可分為亞洲型和非洲型兩個(gè)基因型。
寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測,、IgM抗體檢測,、中和抗體檢測和病毒分離等,。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng),目前主要采用病毒核酸檢測,。
一,、檢測對象
(一)疑似和臨床診斷病例。
(二)伊蚊成蚊和幼蟲,。
二,、樣本采集、保存和運(yùn)輸
(一)病例標(biāo)本采集
對懷疑感染寨卡病毒的患者,,要盡早采集血標(biāo)本,,同時(shí)要采集尿液和唾液標(biāo)本。如果臨床高度懷疑男性為寨卡病毒病,,在上述標(biāo)本無法確診時(shí),,可考慮采集精液開展檢測。
血液標(biāo)本采集辦法:用無菌真空干燥管,,采集患者非抗凝血5 ml,,及時(shí)分離血清,分裝2管,,保存于帶螺旋蓋,、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi),標(biāo)記清楚后低溫保存,,其中1管用于現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)室檢測,,1管用于上級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核。對病例應(yīng)盡可能采集雙份血液標(biāo)本,,兩份標(biāo)本之間相隔14天為宜,,住院病例可于入院當(dāng)天和出院前1天各采集一份。
尿液標(biāo)本的采集方法:采集尿液標(biāo)本10ml,,置于無菌50ml塑料尖底離心管中,,2000rpm離心5min去沉淀,將上清液分裝至無菌15ml離心管中,,每份5 ml,。如需采集精液標(biāo)本,應(yīng)在采集精液標(biāo)本前采集尿液標(biāo)本,。
唾液標(biāo)本的采集方法:將唾液吐入50ml塑料尖底離心管中,,4000rpm離心15min去沉淀,將離心后上清液分裝,,分裝2管,,每份1 ml,保存于帶螺旋蓋,、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)后保存,。
采集精液開展實(shí)驗(yàn)室檢測時(shí),,需采集標(biāo)本1~2 ml,置于無菌干燥,、帶螺旋蓋,、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)后保存。
(二)蚊媒標(biāo)本采集
疫點(diǎn)內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲,,分類鑒定后,,填寫媒介標(biāo)本采集信息表,按照采集地點(diǎn)分裝,,每管10~20只。
(三)標(biāo)本保存,、運(yùn)送
如標(biāo)本能夠在24小時(shí)內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)室檢測,,應(yīng)將標(biāo)本置于2~8℃保存;不能及時(shí)檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快置于-70℃以下保存,。
標(biāo)本運(yùn)送時(shí)采用低溫冷藏運(yùn)輸,,避免凍融,樣本運(yùn)輸應(yīng)遵守國家相關(guān)生物安全規(guī)定,。
三,、檢測方法
寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測,、中和抗體檢測和病毒分離等,。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng),目前主要采用病毒核酸檢測,。
開展蚊媒寨卡病毒檢測時(shí),,主要對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進(jìn)行病毒核酸檢測和病毒分離。
開展寨卡病毒實(shí)驗(yàn)室檢測時(shí),,應(yīng)同時(shí)考慮登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能,。登革病毒和基孔肯雅病毒實(shí)驗(yàn)室檢測應(yīng)按照相應(yīng)的技術(shù)指南開展。
(一)臨床標(biāo)本檢測
1.病原學(xué)檢測
病原學(xué)檢測主要適用于急性期血液標(biāo)本,,一般認(rèn)為發(fā)病7天內(nèi)檢測陽性率高,。
(1)核酸檢測:采用熒光定量RT-PCR方法,是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段,??刹捎弥袊膊☆A(yù)防控制中心病毒病所發(fā)放的熒光定量PCR試劑或其他商品化試劑盒進(jìn)行檢測。
(2)病毒分離:將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞(C6/36)或哺乳動物細(xì)胞(BHK21,、Vero)進(jìn)行分離培養(yǎng),,出現(xiàn)病變或5~7天以后,用檢測核酸的方法鑒定病毒,。也可使用乳鼠腦內(nèi)接種進(jìn)行病毒分離,。
2.血清學(xué)檢測
(1)血清特異性IgM抗體:發(fā)病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體,,但發(fā)病7天后檢出率高??刹捎?span lang="EN-US">ELISA,、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性,,提示患者可能新近感染寨卡病毒,,但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強(qiáng)的交叉反應(yīng),,易于產(chǎn)生假陽性,。
(2)中和抗體:采用空斑減少中和試驗(yàn)方法檢測?;颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高,,且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染,,可以確診,。
3.其他標(biāo)本檢測
尿液、唾液和精液標(biāo)本的檢測可用血清病毒RNA提取試劑盒及核酸特異性檢測試劑進(jìn)行檢測,,結(jié)果判定同血清標(biāo)本,。
(二)媒介標(biāo)本檢測
1.標(biāo)本處理
將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲,按照采集地點(diǎn),,每10~20只為一份進(jìn)行研磨處理,。
2.病毒核酸檢測
用RT-PCR的方法進(jìn)行寨卡病毒核酸檢測。
3.病毒分離
病毒核酸陽性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離,。
四,、生物安全
寨卡病毒按照第三類病原微生物進(jìn)行管理。凡涉及寨卡病毒的分離,、培養(yǎng),、未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料等的操作應(yīng)在生物安全二級(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行;滅活材料和無感染性材料的操作可在生物安全一級(BSL-1)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,。病毒培養(yǎng)物的運(yùn)輸應(yīng)滿足國際民用航空組織公布的《危險(xiǎn)物品安全航空運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》(Doc9284號文件)A類感染性物資的包裝要求,,對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814;未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料(包括患者血、尿液,、唾液或動物體液標(biāo)本以及現(xiàn)場采集的媒介生物標(biāo)本等)運(yùn)輸時(shí)應(yīng)滿足B類感染性物質(zhì)的包裝要求,,對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN3373。開展相關(guān)運(yùn)輸活動須按照原衛(wèi)生部發(fā)布的第45號令《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》進(jìn)行審批后,,方可實(shí)施運(yùn)輸,。
相關(guān)鏈接: